1.準(zhǔn)備工作與材料:
菌種: 選取目標(biāo)微生物(細(xì)菌、酵母等常用),確保其為純培養(yǎng)物且處于對數(shù)生長后期(此時細(xì)胞活力強、耐受性好)。
培養(yǎng)基: 選擇適合該菌種的液體培養(yǎng)基(如LB肉湯、YPD液體培養(yǎng)基等)。
保護劑:無菌甘油溶液(常用終濃度15%-30%,推薦50%或60%甘油母液)。
容器:無菌凍存管,要求能耐受超低溫。
儀器耗材: 超凈工作臺、恒溫?fù)u床/培養(yǎng)箱、渦旋振蕩器、無菌移液器及吸頭、冰盒、記號筆。
低溫設(shè)備:-80℃超低溫冰箱(首選)或液氮罐。
2.菌體培養(yǎng)與收集:
在無菌條件下,將目標(biāo)菌種接種到適量(如5-10ml)液體培養(yǎng)基中。
置于適宜溫度下振蕩培養(yǎng)(或靜置培養(yǎng),視菌種而定),直至達到對數(shù)生長后期(OD值監(jiān)測或根據(jù)經(jīng)驗判斷,通常培養(yǎng)過夜后)。
關(guān)鍵點: 避免培養(yǎng)過度進入衰亡期。
3.配制無菌甘油溶液:
通常使用50% (v/v) 或 60% (v/v) 的甘油水溶液作為母液。
將分析純甘油與蒸餾水按比例混合(如50ml甘油 + 50ml 蒸餾水配成50%甘油)。
嚴(yán)格滅菌: 將配好的甘油溶液分裝于合適容器(如帶螺帽試管),高壓蒸汽滅菌(121℃,15-20分鐘)。冷卻后備用。滅菌后務(wù)必混勻一次,防止分層。
4.菌懸液制備與混合甘油:
若使用50%甘油母液:混合比例為 1體積母液 : 2.33體積菌懸液 (即 0.3ml甘油母液 + 0.7ml菌懸液)。
若使用60%甘油母液:混合比例為 1體積母液 : 3體積菌懸液 (即 0.25ml甘油母液 + 0.75ml菌懸液)。
直接法(常用): 離心(如4000 rpm, 10分鐘)收集菌體,棄上清。用適量(如原培養(yǎng)液體積的1/2)新鮮無菌培養(yǎng)基或無菌生理鹽水(0.85% NaCl) 重懸菌體,制成濃菌懸液。
間接法(操作更簡單): 直接吸取適量對數(shù)后期的新鮮菌液(無需離心)。
在無菌條件下(超凈臺內(nèi)操作),將培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)移至無菌離心管中。
根據(jù)實驗需要,可選擇:
取等體積的無菌甘油母液(50%或60%)與上述制備好的濃菌懸液或新鮮菌液在無菌凍存管中混合。
計算示例(終濃度15%甘油):
使用渦旋振蕩器或反復(fù)吹打,確保菌體與甘油充分、均勻混合。最終混合物應(yīng)呈現(xiàn)均一、輕微渾濁狀態(tài)。
5.分裝與標(biāo)記:
菌種名稱(全稱或標(biāo)準(zhǔn)縮寫)
菌株編號(如有)
保存日期(年月日)
操作者姓名/縮寫
甘油終濃度(可選,但推薦)
將混合好的菌液-甘油懸液,分裝到預(yù)冷的無菌凍存管中。推薦體積: 0.5ml - 1.0ml(體積過小易干涸,過大冷凍/融化速度不均)。
立即、清晰、牢固地標(biāo)記凍存管:
重要: 使用耐低溫、防水的記號筆或標(biāo)簽紙(專用低溫標(biāo)簽)。
6.預(yù)冷與冷凍:
將預(yù)冷后的凍存管迅速轉(zhuǎn)移至 -80℃超低溫冰箱 或投入 液氮氣相(液氮罐液面之上)中保存。
目的:使樣品快速通過冰晶形成最危險的溫度區(qū)域(0℃至-40℃),減少大冰晶對細(xì)胞的損傷。
將分裝標(biāo)記好的凍存管置于冰盒中預(yù)冷10-15分鐘。(此步可顯著提高某些敏感菌的存活率)
快速冷凍(推薦,尤其對冷凍敏感的菌種):
慢速冷凍(較少用): 將凍存管放入程序降溫盒中,再將盒子整體置于-80℃冰箱。盒內(nèi)異丙醇能提供約-1℃/分鐘的降溫速率。適用于極少數(shù)對快速冷凍敏感的菌株(需驗證)。
7.長期保存:
將凍存管穩(wěn)定保存在 -80℃超低溫冰箱 或 液氮罐(液相或氣相) 中。-80℃保存最為常用便捷。
確保冰箱/液氮罐工作穩(wěn)定,定期添加液氮或檢查設(shè)備運行狀態(tài)。
8.復(fù)蘇(簡要):
需要使用時,從低溫環(huán)境中快速取出目標(biāo)凍存管(避免在室溫停留過久導(dǎo)致冰晶融化損傷細(xì)胞)。
立即置于 37-42℃溫水浴 中(或根據(jù)菌種最適生長溫度調(diào)整),快速振蕩融化(通常1-2分鐘內(nèi)完成)。
在無菌條件下,用移液器吸取適量融化的菌液(建議全部或大部分),接種到合適的固體或液體培養(yǎng)基上。
置于適宜條件下培養(yǎng),檢查菌種存活情況及純度。
1.無菌操作是生命線: 整個操作過程(從菌液轉(zhuǎn)移、甘油加入、分裝到標(biāo)記)必須在超凈工作臺內(nèi)嚴(yán)格按照無菌操作規(guī)范進行。任何污染都將導(dǎo)致保存失敗或菌種不純。
2.菌齡至關(guān)重要: 務(wù)必使用對數(shù)生長后期的健康細(xì)胞。過早(活力不足)或過晚(細(xì)胞老化、自溶)都會顯著降低復(fù)蘇率。
3.甘油濃度需精確: 終濃度通常在 15%-30% 之間(常用15%-20%)。濃度過低保護不足,過高可能產(chǎn)生滲透壓毒性或?qū)е虏AB(tài)轉(zhuǎn)變溫度升高不利于保護。務(wù)必使用無菌甘油溶液,并確;旌暇鶆。
4.冷凍速度的選擇:快速冷凍(直接放-80℃)適用于絕大多數(shù)細(xì)菌和酵母,能有效減少冰晶損傷。僅對文獻報道或經(jīng)驗證對快凍敏感的少數(shù)菌株考慮程序慢凍。
5.溫度穩(wěn)定性:-80℃超低溫冰箱 是首選。避免使用普通 -20℃冰箱長期保存,此溫度下冰晶仍會緩慢生長,導(dǎo)致細(xì)胞損傷,保存期大大縮短(通常僅數(shù)月)。
6.避免反復(fù)凍融: 冷凍保存的菌種嚴(yán)禁反復(fù)凍融。每次復(fù)蘇后,該凍存管即應(yīng)棄用。如需再次使用,應(yīng)從保存的原始凍存管中取用,或復(fù)蘇后重新制備新的甘油保存管。
7.清晰準(zhǔn)確的標(biāo)記: 模糊、脫落或信息不全的標(biāo)簽是實驗室事故的常見根源。使用專用低溫標(biāo)簽和記號筆,確保信息完整、永久清晰。
8.安全防護:
操作液氮時必須佩戴防凍手套(如厚皮手套或?qū)S靡旱痔祝┖妥o目鏡,防止凍傷和濺射傷害。
使用-80℃冰箱存取樣品時,也建議佩戴防凍手套,避免皮膚直接接觸超低溫金屬表面。
9.復(fù)蘇操作要快速: 融化過程務(wù)必快速(溫水浴振蕩),并立即將復(fù)蘇菌種轉(zhuǎn)移至適宜培養(yǎng)基中,減少甘油對細(xì)胞的潛在毒性作用。
10.定期檢查與備份: 定期(如每年)復(fù)蘇檢查關(guān)鍵菌種的存活情況。對于極其重要的菌株,建議在不同設(shè)備或位置進行備份保存(如保存兩管在不同冰箱/液氮罐),以防設(shè)備故障。
11.菌種特異性: 不同微生物對冷凍保存的耐受性不同。對于特殊或珍貴的菌株,建議查閱相關(guān)文獻或進行預(yù)實驗優(yōu)化甘油濃度和冷凍條件。
12.凍存管質(zhì)量: 確保使用高質(zhì)量、密封良好、耐超低溫的凍存管。劣質(zhì)凍存管在低溫下易破裂或密封失效,導(dǎo)致樣品污染或干涸。
總結(jié)
甘油菌種冷凍保存法是一種高效可靠的微生物長期保藏技術(shù)。其成功的關(guān)鍵在于嚴(yán)格的無菌操作、使用對數(shù)期健康菌體、精確配制無菌甘油溶液、確保充分混勻、采用合適的冷凍速度(通?焖倮鋬觯⒎(wěn)定保存在-80℃或更低溫度、清晰的標(biāo)記以及避免反復(fù)凍融。熟練掌握操作步驟并嚴(yán)格遵守注意事項,能最大程度地保證微生物菌種的活力、純度和遺傳穩(wěn)定性,為科研、教學(xué)和產(chǎn)業(yè)應(yīng)用提供寶貴的生物資源庫。在操作中務(wù)必時刻牢記生物安全規(guī)范和個人防護,確保實驗過程安全順利。