一、 核心原理：稀釋與分離

平板劃線法的核心思想非常簡單：“稀釋”。

想象一下，你有一杯非常濃的果汁，想要品嘗到最純粹的一滴水，你會不斷地加水稀釋它。平板劃線法也是同理，只不過我們稀釋的對象是混雜的菌液，而“水”變成了固體的培養(yǎng)基。

1、固體培養(yǎng)基的作用：我們使用添加了瓊脂的固體培養(yǎng)基。它像一塊果凍，為微生物提供了生長的固定場所。一個(gè)微生物細(xì)胞被固定在一個(gè)位置后，會不斷分裂繁殖，形成成千上萬個(gè)相同的子代細(xì)胞，最終形成一個(gè)肉眼可見的、由一個(gè)祖先繁衍而來的菌落。

2、劃線的目的：通過接種環(huán)在平板表面有規(guī)律地劃線，其物理動作實(shí)際上是在將菌液一次次地“抹開”。每劃完一個(gè)區(qū)域，接種環(huán)上的菌液數(shù)量就減少一個(gè)數(shù)量級。經(jīng)過幾輪的劃線稀釋，最終，個(gè)別微生物細(xì)胞會被單獨(dú)留在平板表面的某個(gè)點(diǎn)上。

3、純菌落的出現(xiàn)：這些被單獨(dú)留下的細(xì)胞經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)（通常18-24小時(shí)），就會生長形成孤立、獨(dú)立的單個(gè)菌落。這個(gè)菌落理論上就是由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來的純種，即我們所需的“純培養(yǎng)”。

二、 所需材料與準(zhǔn)備工作

• 培養(yǎng)基：適于待分離微生物生長的瓊脂平板（如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于細(xì)菌，PDA培養(yǎng)基用于真菌）。

• 接種工具：接種環(huán)。

• 樣品：含有待分離微生物的混雜菌液或樣品懸液。

• 其他：無菌工作臺（超凈工作臺或酒精燈提供無菌環(huán)境）、恒溫培養(yǎng)箱、標(biāo)記筆等。

關(guān)鍵：整個(gè)操作過程必須在無菌條件下進(jìn)行，防止空氣中的雜菌污染平板，導(dǎo)致分離失敗。

三、 標(biāo)準(zhǔn)操作步驟（以最常用的四區(qū)劃線法為例）

四區(qū)劃線法是最高效、最易獲得單菌落的方法，非常適合初學(xué)者。

1、標(biāo)記與準(zhǔn)備：在平板底部用標(biāo)記筆注明樣品信息、日期和操作者姓名。將接種環(huán)在酒精燈外焰上徹底灼燒至通紅，然后冷卻片刻。

2、取菌：用冷卻后的無菌接種環(huán)伸入菌液樣品或斜面上，蘸取少量菌種。

3、第一區(qū)劃線：將沾有菌種的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面的一側(cè)（約占1/4面積）進(jìn)行密集的、不重疊的“之”字形劃線（如圖A區(qū)）。此區(qū)域菌液濃度最高，菌落會長得非常密集，甚至連成一片。

4、二次灼燒：完成第一區(qū)后，立即將接種環(huán)在火焰上灼燒滅菌，殺死環(huán)上剩余的菌液。等待接種環(huán)冷卻！（否則會燙死下一區(qū)的微生物）

5、第二區(qū)劃線：將冷卻的無菌接種環(huán)穿過第一區(qū)的劃線區(qū)域1-2次，然后在不與第一區(qū)交叉的空白區(qū)域（B區(qū)）進(jìn)行新一輪的“之”字形劃線。此時(shí)，接種環(huán)上僅沾有從第一區(qū)帶來的少量細(xì)菌，實(shí)現(xiàn)了第一次稀釋。

6、三次灼燒與第三區(qū)劃線：再次灼燒接種環(huán)，冷卻后，穿過第二區(qū)1-2次，在空白區(qū)域（C區(qū)）劃線，進(jìn)行第二次稀釋。

7、四次灼燒與第四區(qū)劃線：最后一次灼燒接種環(huán)，冷卻后，穿過第三區(qū)，在最后的空白區(qū)域（D區(qū)）進(jìn)行劃線，完成最終稀釋。

8、培養(yǎng)：劃線完成后，將平板倒置（防止冷凝水滴落沖散菌落），放入恒溫培養(yǎng)箱中，在適宜溫度下培養(yǎng)18-24小時(shí)。

四、 結(jié)果判讀與純化

培養(yǎng)后，取出平板觀察。你會看到：

• 第一區(qū)：菌落密集，難以區(qū)分。

• 第二、三區(qū)：菌落數(shù)量減少，逐漸出現(xiàn)分散的單個(gè)菌落。

• 第四區(qū)： ideally，會出現(xiàn)彼此分離、間隔良好的單個(gè)菌落。

這些單個(gè)菌落通常形態(tài)、大小、顏色、光澤一致。此時(shí)，你需要用無菌接種環(huán)輕輕挑取一個(gè)你認(rèn)為最理想的獨(dú)立菌落，將它重新劃線或接種到新的斜面培養(yǎng)基上。經(jīng)過再次培養(yǎng)，由此得到的培養(yǎng)物就是該微生物的純培養(yǎng)。

五、 成功的關(guān)鍵與技巧

• 無菌操作是生命線：任何污染都會讓實(shí)驗(yàn)前功盡棄。

• 接種環(huán)冷卻要徹底：熱接種環(huán)會殺死微生物，導(dǎo)致無菌生長。

• 劃線的力度要輕柔：切勿劃破培養(yǎng)基表面，否則菌會滲入培養(yǎng)基內(nèi)部，影響菌落形態(tài)和分離效果。

• 合理分區(qū)：確保后一區(qū)的劃線僅與前一區(qū)有少量交叉，這樣才能有效稀釋。

• 練習(xí)造就完美：熟練的劃線手法需要反復(fù)練習(xí)才能達(dá)到最佳稀釋效果。

六、 應(yīng)用與意義

平板劃線分離法不僅是微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的“第一課”，更是所有微生物相關(guān)研究和應(yīng)用的基礎(chǔ)：

• 臨床診斷：從病人樣本（如痰、血液、尿液）中分離致病菌，是確定感染原、進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的第一步。

• 食品工業(yè)：分離發(fā)酵菌種（如酵母菌、乳酸菌），或檢測食品中的腐敗菌和致病菌。

• 環(huán)境微生物學(xué)：從土壤、水樣中分離具有特定功能（如降解污染物、固氮）的微生物。

• 科學(xué)研究：獲得純培養(yǎng)是研究微生物遺傳、生理、代謝等所有特性的先決條件。

總結(jié)而言，平板劃線分離法以其簡潔的設(shè)計(jì)、強(qiáng)大的功能和低廉的成本，成為了微生物學(xué)領(lǐng)域經(jīng)久不衰的經(jīng)典技術(shù)。它就像一位精巧的工匠，用最簡單的工具——一個(gè)接種環(huán)和一塊平板，成功地將混亂的微生物世界分解成一個(gè)個(gè)可供我們研究和利用的純粹個(gè)體。