革蘭氏染色的差異源于細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分的不同。

革蘭氏陽(yáng)性菌（G⁺）：細(xì)胞壁厚，富含肽聚糖和磷壁酸，結(jié)構(gòu)致密。在經(jīng)過(guò)乙醇或丙酮脫色時(shí)，肽聚糖層脫水收縮，使得結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被牢牢鎖在細(xì)胞壁內(nèi)，不易被洗脫，因此最終呈現(xiàn)紫色或藍(lán)色。

革蘭氏陰性菌（G⁻）：細(xì)胞壁薄，肽聚糖層較薄，但外膜含有豐富的脂多糖和脂質(zhì)。脫色劑能溶解外膜的脂質(zhì)，破壞細(xì)胞壁完整性，形成孔隙，從而使結(jié)晶紫-碘復(fù)合物極易被洗脫。當(dāng)復(fù)染劑沙黃或品紅加入后，細(xì)胞便被染成紅色或粉色。

1、菌種：待測(cè)細(xì)菌的新鮮培養(yǎng)物（通常為18-24小時(shí)菌齡）。

2、載玻片、接種環(huán)、酒精燈、洗瓶、顯微鏡。

3、四種關(guān)鍵試劑（按使用順序）：

初染劑：結(jié)晶紫（Crystal Violet）

媒染劑：路哥氏碘液（Lugol's Iodine）

脫色劑：95%乙醇（Ethanol）或丙酮-乙醇混合液

復(fù)染劑：沙黃（Safranin）或稀釋石炭酸品紅（Carbol Fuchsin）

第一步：涂片、固定

1、制備涂片：取一滴無(wú)菌水或生理鹽水于載玻片中央，用無(wú)菌接種環(huán)挑取少量菌落，均勻涂布成直徑約1厘米的薄層膜。

2、風(fēng)干：在空氣中自然風(fēng)干。

3、熱固定：將涂有菌膜的一面朝上，快速通過(guò)酒精燈火焰2-3次。此步驟旨在殺死細(xì)菌并使其牢固附著在玻片上，但需避免過(guò)度加熱導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)改變。

第二步：結(jié)晶紫初染

1、用結(jié)晶紫染液覆蓋菌膜，染色1分鐘。

2、用緩流自來(lái)水輕輕沖洗，洗去多余染液，甩干玻片上多余水分。

第三步：碘液媒染

1、用路哥氏碘液覆蓋菌膜，染色1分鐘。

2、碘液作為媒染劑，能與結(jié)晶紫形成分子量更大、溶解度更低的結(jié)晶紫-碘復(fù)合物（CV-I Complex）。

3、再次用緩流自來(lái)水輕輕沖洗，甩干。

第四步：乙醇脫色（最關(guān)鍵的一步）

1、將載玻片傾斜，用95%乙醇滴流沖洗涂片，直至流下的乙醇幾乎無(wú)色（此過(guò)程通常僅需5-15秒，具體時(shí)間需經(jīng)驗(yàn)判斷）。

2、立即用緩流水輕輕沖洗，終止脫色。

第五步：沙黃復(fù)染

1、用沙黃染液覆蓋菌膜，復(fù)染30秒至1分鐘。

2、用緩流自來(lái)水沖洗干凈，用吸水紙輕輕吸干或自然風(fēng)干。

鏡檢：待玻片完全干燥后，在油鏡下（100×物鏡）觀察。紫色為革蘭氏陽(yáng)性菌（G⁺），紅色為革蘭氏陰性菌（G⁻）。

Q1：脫色環(huán)節(jié)如何把握？時(shí)間太短或太長(zhǎng)會(huì)怎樣？

問(wèn)題：脫色是革蘭氏染色中最需要經(jīng)驗(yàn)的一步，難以精確計(jì)時(shí)。

影響：

脫色不足：如果乙醇作用時(shí)間太短，所有細(xì)菌（包括G⁻菌）的CV-I復(fù)合物都未被充分洗脫，在復(fù)染后G⁻菌也可能呈現(xiàn)紫色，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。

脫色過(guò)度：如果乙醇作用時(shí)間太長(zhǎng)，G⁺菌細(xì)胞壁中的CV-I復(fù)合物也會(huì)被部分或全部洗脫，隨后被染成紅色，導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

解決方案：采用滴流法而非浸泡法，并密切觀察流出液的顏色，當(dāng)其從深紫色變?yōu)榈�紫色或無(wú)色時(shí)立即停止。新手可用已知的G⁺（如金黃色葡萄球菌）和G⁻（如大腸桿菌）菌株做對(duì)照練習(xí)。

Q2：為什么會(huì)出現(xiàn)“革蘭氏可變性”或結(jié)果不明確？

菌齡問(wèn)題：使用老齡細(xì)菌（培養(yǎng)超過(guò)24-48小時(shí)）時(shí)，G⁺菌的細(xì)胞壁可能受損，肽聚糖降解，導(dǎo)致脫色時(shí)染料泄漏而呈紅色或紫色不均勻（革蘭氏可變性）。

涂片過(guò)厚：菌膜過(guò)厚會(huì)使脫色劑無(wú)法均勻作用，內(nèi)部細(xì)菌脫色不充分，可能導(dǎo)致G⁻菌核心呈紫色，外圍呈紅色。

解決方案：始終使用18-24小時(shí)內(nèi)的新鮮培養(yǎng)物制備薄而均勻的涂片。

Q3：染色結(jié)果中背景有沉淀或雜質(zhì)怎么辦？

問(wèn)題：視野中有大量顆粒狀沉淀，影響觀察。

原因：通常是染液沉淀或涂片清洗不徹底所致。

解決方案：確保所有染液經(jīng)過(guò)過(guò)濾且無(wú)沉淀；每一步?jīng)_洗后應(yīng)充分甩干玻片上的積水，再進(jìn)行下一步操作。

Q4：熱固定時(shí)需要注意什么？

問(wèn)題：固定不牢或細(xì)胞變形。

影響：固定不牢會(huì)導(dǎo)致菌體在染色沖洗過(guò)程中被沖走；過(guò)度加熱會(huì)使細(xì)胞扭曲、破裂，影響形態(tài)觀察和染色結(jié)果。

解決方案：將玻片在火焰上以不燙手背的溫度快速通過(guò)2-3次即可。

Q5：鏡檢時(shí)視野中找不到細(xì)菌或細(xì)菌數(shù)量很少？

原因：可能因涂片時(shí)菌量取得太少，或沖洗步驟水流過(guò)猛將菌膜沖掉。

解決方案：挑取適量菌苔，確保涂片有足夠的細(xì)菌密度；所有沖洗步驟必須使用緩流的水，并讓水從玻片一端流下，避免直接沖刷菌膜區(qū)域。