對于在-80℃保存時間較久的甘油菌，有可能出現(xiàn)以下情況：（1）被雜菌污染；（2）目的菌質(zhì)粒丟失；（3）目的菌活性變低。所以，需要通過平板劃線、篩選培養(yǎng)，重新獲得高活性的單個目的菌。

二、如何進行平板劃線？

1、三區(qū)平板劃線

將平板劃分為三個逐漸縮小的區(qū)域，接種環(huán)依次密集到稀疏劃線，并與前一區(qū)輕微搭接，通過逐級稀釋在第三區(qū)獲得單菌落，常用于臨床標(biāo)本的首次分離，尤其適合菌量不高的樣品。

2、四區(qū)平板劃線

在三區(qū)基礎(chǔ)上增加一個區(qū)域，四個區(qū)域依次遞減、輕微搭接，稀釋效果更徹底，能進一步降低菌量密度，適合污染嚴(yán)重或菌量高的樣品，提高純培養(yǎng)的成功率。

3、單次連續(xù)之字劃線

接種環(huán)從平板一端到另一端連續(xù)劃“之”字，不交叉、不重復(fù)，使菌液沿全程均勻分布，適合菌量已知的純培養(yǎng)或增菌液接種；也可用于混合樣本分離，但稀釋梯度不如分區(qū)劃線明顯，獲得單菌落的概率相對較低。

4、網(wǎng)狀平板劃線

先做一次“之”字劃線，再將平板旋轉(zhuǎn)90°進行垂直劃線，形成交叉網(wǎng)格，增加劃線面積和稀釋機會，適合生長緩慢或菌落細小的微生物分離，但交叉處菌落可能過密。

三、三區(qū)平板劃線操作步驟

1、 左手拿培養(yǎng)皿，右手持接種環(huán)，打開蓋子一條縫隙，將沾菌接種環(huán)在平皿邊緣“之”字劃第一區(qū)域（約 1/4～1/5 面積）。

2、 轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約 120°，灼燒冷卻接種環(huán)，從第一區(qū)末端帶菌在第二區(qū)劃線。

3、 再轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約 120°，灼燒冷卻接種環(huán)，從第二區(qū)末端帶菌在第三區(qū)劃線。

⚠️ 注意：各區(qū)劃線僅與前一區(qū)少量相交，絕不與其他區(qū)域重疊；全程應(yīng)在超凈工作臺中進行。

四、常見問題及解決辦法

   原因：菌量過大或劃線過密，稀釋梯度不足。 

   解決：甘油菌先 10⁻⁴～10⁻⁵ 稀釋；第二、三區(qū)再稀疏些；必要時改用四區(qū)法。

2、平板無菌落 

   原因：菌已失活或接種量過少；抗性平板選錯抗生素；培養(yǎng)條件不符。 

   解決：換用新鮮甘油菌、降低抗生素濃度、檢查培養(yǎng)溫度/氣體條件。

3、雜菌覆蓋目的菌 

   原因：甘油菌污染或操作污染。 

   解決：重新劃線時加入目的菌特需抗性/顯色底物；操作前用75%酒精擦拭工作臺并紫外再照15 min；必要時用無菌濾紙貼蓋法二次純化。

4、 單菌落過少或分布不均 

   原因：接種環(huán)未充分冷卻殺死部分菌；旋轉(zhuǎn)角度不足導(dǎo)致稀釋梯度不足。 

   解決：灼燒后冷卻 5–10 s；確保每區(qū)旋轉(zhuǎn)≈120°；可在第三區(qū)尾端再輕劃兩條補充線。